保姆級細胞凍存方法

凍

存

細

胞

培

養

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。

利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。

既可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，又起到了細胞保種的作用。

在不附加任何保護劑下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。

因此，凍存時，應向培養液中加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞。貯存在液氮中能減少冰晶的形成。

實驗開始前，要先做好準備工作：

將凍存管、離心管、移液管、移液器等耗材準備齊全，放入超凈臺中，打開紫外線照射 30 分鐘。打開通風機通風 3 分鐘。用 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準備好冰盒。

將離心機調節至所需轉速，細胞完全培養基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中預熱。

凍存步驟：

1、取出細胞，酒精消毒，放入超凈臺。

Tip1：應在細胞生長良好、致密度約為 80-90％，活力達 90%以上的狀態下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。

2、配置細胞凍存液：按無血清培養基：血清 ：DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液。

Tip2：DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色，可以用 0.22 微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產品。以 5-10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

Tip3：因DMSO 本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進行高壓滅菌。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保存效果。

Tip4：在常溫下，DMSO 對人體有害，應注意生物安全防護。

Tip5：凍存液應該提前配制，防止臨時配制產生的熱量損傷細胞。

Tip6：加大凍存液中血清的比例對于保存某些脆弱的干細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。

3、按照細胞傳代步驟，對細胞進行消化、解離。

4、消化好的細胞離心后，棄掉上清液，用凍存液重懸。

Tip7：用移液器吸去上清液時，不要吸到底部的細胞沉淀。

Tip8：用移液器輕柔吹打細胞，避免損傷細胞。

Tip9：混勻 DMSO 要快，因為 DMSO 對細胞有毒性，混合后應盡快凍存。

5、可用細胞計數板或計數儀器對細胞進行計數，將細胞總數調節至細胞數量為5×10?個/ml為宜。

6、將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入 1 -1.5 ml細胞凍存懸液為宜。

7、放入專業的細胞凍存盒中，或者按照：

﹣4 ℃ 30 分鐘→20 ℃ 30 分鐘→﹣80 ℃過夜→液氮保存的順序進行凍存。

Tip10：復蘇遵循快速解凍的原則，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。而細胞凍存則要緩慢冷凍，目的是使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶從而降低對細胞的傷害。

對于大多數細胞來說，每分鐘降 1-3℃是合適的。

剛剛有提到，在細胞凍存過程中，適當提高血清的比例，更有利于提高對脆弱細胞的保護。

血清不僅提供營養上的支持，作為細胞生長的媒介之一，其品質優劣，直接影響細胞的長勢，從而影響實驗結果的產出。

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