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蛋白質組學再立戰功：揭示了BCAT1在癌細胞轉移中的重要作用

2021-12-03 14:38來源：威正翔禹|締一生物

癌癥是對人類健康威脅**的疾病之一。根據世界衛生組織（WHO）的統計，2018 年全球新發癌癥病例達到 1,807 萬例，其中肺癌 209 萬例，發病率名列前茅。

中國癌癥新發患者人數也在逐年增加，根據國家癌癥中心發布的全國最新癌癥數據，2015 年全國新發惡性腫瘤病例數約 392.9 萬例，肺癌位居發病首位。


肺癌患病率逐年攀升，轉移是肺癌高死亡率的主要原因之一，嚴重危害人類公共健康。


肺癌是如何轉移的？

哪些因素會影響肺癌轉移？

如何斷了癌細胞后路，避免其轉移？


這些問題一直困擾著研究人員。


近日，《Theranostics》上發表了一篇標題為：“Proteomic analysis of lung cancer cells reveals a critical role of BCAT1 in cancer cell metastasis”的論文，或許可以在一定程度上回答上述問題。



圖片來源：https://www.thno.org/v11p9705.htm

點擊文末閱讀原文，即可獲得完整文獻


濃縮精華版：


研究人員發現：在轉移性肺癌細胞和肺癌患者的轉移性組織中，分支鏈氨基酸代謝的關鍵酶BCAT1蛋白水平呈現過表達狀態。通過數據分析分析得出結論：BCAT1轉錄的增加，與肺癌患者總生存率較低之間存在關聯性。



感興趣的小伙伴可以接著往下看，有詳細版。


圖片


在過去的十年中，基因組測序越來越多地被應用到轉移性腫瘤突變譜的研究中 [1，2]。已有一些研究，對肺癌患者標本進行了全面的蛋白質基因組學研究，繪制了呈現了原發腫瘤相對于腫瘤旁“正常”組織的蛋白質組圖 [3，4]。然而，關于轉移性肺癌的蛋白質組水平的相關研究仍然不足。


我們已經知道，氨基酸代謝在腫瘤發生和轉移中起重要作用。


氨基酸密碼子對照表


支鏈氨基酸(BCAA)到α-酮戊二酸(α-KG)的轉氨基反應，由胞質BCAT1和線粒體BCAT2兩種類型的bcat基因催化。該反應產生谷氨酸，而谷氨酸又可以被腫瘤細胞優先利用以促進生存[5]。


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由此得到的支鏈酮酸(BCKA)進一步分解為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，它們是TCA循環的中間體[6]。BCAT1的過表達與髓樣白血病[7]、膠質瘤[8]和非小細胞肺癌[9]的癌癥進展有關，而增加BCAA攝取對于維持NSCLC[10]的腫瘤發生很重要。然而，BCAT1的表達過程，是否在轉移性腫瘤中出現紊亂？在潛在的遷移過程中發揮作用？這些目前尚不清楚。


為了確定與肺癌轉移狀態相關的蛋白質組學的變化，研究人員用到了一種同位素標記(SILAC：細胞培養穩定同位素標記，在細胞培養過條件下，用含有輕、重同位素標記氨基酸的培養基，進行細胞培養，若干代后，細胞中的蛋白質被穩定標記上同位素)的定量質譜分析。


利用原發性肺腺癌A549細胞系(指定L0)和L0細胞進行了三輪BALB/c Nude小鼠體內選擇，產生脊柱轉移細胞(指定L2和L6)[11]。然后，分別在“輕、中、重”三種同位素標記的培養基進行培養，穩定標記后進行質譜定量分析。


得到結果1

  • 轉移細胞顯示出與原代細胞不同的蛋白質表達譜。相對于L0細胞，L6細胞中有74個蛋白、L2中有86個蛋白發生了顯著變化。

  • 在顯著改變的蛋白質中，33個在兩種轉移細胞系(L2和L6)中出現重疊。

  • 最顯著富集的通路是氨基酸代謝過程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉移細胞中最一致的上調蛋白。并且，上調蛋白的mRNA水平也升高。


隨后，作者又比較分析了四對，來自腫瘤患者樣本的原發和轉移性腫瘤組織進行蛋白質組學。


采用串聯質譜(TMT)標記和質譜定量分析方法檢測蛋白表達，利用TCGA數據進行分析。


得到結果2

  • 鑒定出14個變化顯著的蛋白。其中大部分改變的蛋白參與免疫反應通路，包括干擾素- γ和PPAR信號通路。這些改變的蛋白也存在于先前SILAC質譜分析得到的數據庫中。

  • 患者的總生存期(OS, n = 241)與BCAT1表達呈負相關 ，表明，BCAT1可能是肺癌進展的一個弱預后標志物。


接著，研究人員利用A549細胞系，進行了一系列細胞學實驗以及分子實驗：Western blot、trans-well、RNA干擾等，以及小鼠體內實驗，進一步探究BCAT1在轉移中的作用。


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得到結果3

  • 與使用原代和轉移性A549細胞株的SILAC蛋白質組學結果一致，Western blot檢測BCAT1發現在轉移性細胞中顯著增加。

  • L2和L6細胞的遷移能力明顯高于原代L0細胞，說明轉移性更高。

  • 穩定表達shRNA對抗BCAT1 (shBCAT1)的L2和L6細胞，并進行了反轉錄實驗。表達shBCAT1的細胞的遷移速度明顯慢于表達重組shRNA的對照細胞。

  • 體內實驗發現：與對照組細胞相比，接種表達shBCAT1的L6細胞的小鼠的癌細胞轉移率降低。

  • 對主要轉移部位(股骨和脛骨)的Micro-CT分析顯示，接種轉移細胞的小鼠有嚴重的骨性侵蝕(與L6和L0細胞相比)，而接種表達shBCAT1的轉移細胞的小鼠骨性侵蝕小得多。

  • 最終得出結論：敲除BCAT1后，體外轉移的L2和L6細胞遷移能力減弱，體內骨轉移的嚴重程度大大降低，幾乎達到L0水平。BCAT1的過表達可能驅動肺癌細胞轉移，而降低BCAT1的表達抑制了癌細胞的遷移和轉移。


為了深入了解BCAT1介導的轉移的機制，研究人員檢測了與干細胞和上皮-間質轉化(EMT)相關基因的表達。


得到結果4

  • 在L2和L6細胞中，干細胞轉錄因子SOX2在mRNA和蛋白水平均顯著升高。



SOX2是維持胚胎干細胞和腫瘤干細胞可塑性的轉錄因子，它的過表達促進了肺癌的轉移。在已有研究中，SOX2的表達增加可能會使L0細胞進入低分化狀態，遷移能力增加。


文章作者從先前的研究[11]中重新分析了這些A549細胞的RNA-seq數據。


得到結果5

  • SOX2下游的許多基因在L2和L6細胞中均顯著上調，包括Wnt信號基因NOTCH3、DVL1、DVL2和致癌基因KLF4。

  • 與SOX2相互作用的轉錄因子，包括FOXK1和FOXC1，增加了表達。

  • 最顯著富集的通路是氨基酸代謝過程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉移細胞中最一致的上調蛋白。并且，上調蛋白的mRNA水平也升高。


然而，在先前的SILAC實驗結果中，轉移細胞中包括CTNNB1和DVL2在內的Wnt信號蛋白減少。He等人之前的一項研究也表明，過表達SOX2可能通過上調A549細胞[12]中的GSK3β，導致Wnt/β-catenin信號通路的抑制。


因此，作者假設SOX2通過β-catenin抑制Wnt信號，維持轉移細胞的未分化狀態。


為了驗證這一假設，研究人員用幾種不同的方式：熒光成像、流式細胞術、Western blot、Real-time PCR，確定了BCAT1在轉移性A549細胞中促進了SOX2的表達，這一新的途徑可能是肺癌細胞干性的重要調控因子。


得到結果6

  • α-KG水平確實在L2和L6細胞中降低，而降低BCAT1的表達部分恢復了α-KG水平。

  • 谷氨酸、KIV和BCAAs在轉移細胞中積累。

  • 隨著降低BCAT1的表達，這些氨基酸和酮酸的水平也會降低。由于α-KG是DNA去甲基化酶TET2的輔助因子，降低α-KG濃度可能導致靶基因啟動子區域的高甲基化，從而沉默這些基因。

  • 檢測了DNA甲基化，發現L2和L6細胞中5-甲基脫氧胞嘧啶(5mdC)顯著升高，表明DNA有整體高甲基化的趨勢。

  • 在表達sh-BCAT1的L2和L6細胞中，5mdC大量減少。此外，在L2和L6細胞中觀察到組蛋白甲基化增加的現象。


TET2調控的許多基因中有編碼micro-RNAs的基因，已有研究表明miR200家族成員是SOX2的負調控因子。


這提出了一種可能性：


即bcat介導的α-KG的減少導致miR200家族成員的高甲基化，并解除了SOX2的翻譯抑制。



分析顯示miR200c的表達與BCAT1呈負相關。



有報道稱：miR-200c表達的丟失在NSCLC中誘導了侵襲性表型。研究人員測量了miR200c，以及其他后續實驗。


得到結果7

  • miR200c在L2和L6細胞中觀察到統計學上顯著的大幅減少。

  • 敲除BCAT1可增加miR200c的表達。

  • 另外兩種可以靶向SOX2 mRNA的microRNA：miR429和miR21-5p，在BCAT1敲除后也表現出類似的效果，盡管它們在轉移細胞中表達水平不同。

  • 添加DM-α-KG(一種能夠穿透細胞膜的α-KG類似物)，可以在L2和L6細胞中以劑量依賴性的方式降低SOX2的表達。

  • DM-α-KG治療也增加了轉移細胞中的miR200c。


因此，研究人員認為：

BCAT1-α-KG-miR200c-SOX2

調控途徑成立！


綜上所述，研究發現BCAT1在轉移性肺癌細胞中表達上調，調控其遷移轉移，并與不良預后相關。該研究確定了一條新的通路，其中α-KG是轉移性肺癌細胞中BCAT1和SOX2表達轉錄后調控之間的關鍵代謝信號傳導中間體。


這些發現可能為靶向肺癌轉移過程的治療開辟新的策略。



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參考文獻


[1] Zehir A, Benayed R, Shah RH, Syed A, Middha S, Kim HR. et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat. Med. 2017;23(6):703-713


[2]Yaeger R, Chatila WK, Lipsyc MD, Hechtman JF, Cercek A, Sanchez-Vega F. et al. Clinical sequencing defines the genomic landscape of metastatic colorectal cancer. Cancer Cell. 2018;33(1):125-136.e3


[3]Xu J-Y, Zhang C, Wang X, Zhai L, Ma Y, Mao Y. et al. Integrative proteomic characterization of human lung adenocarcinoma. Cell. 2020;182(1):245-261.e17


[4]Chen Y-J, Roumeliotis TI, Chang Y-H, Chen C-T, Han C-L, Lin M-H. et al. Proteogenomics of non-smoking lung cancer in East Asia delineates molecular signatures of pathogenesis and progression. Cell. 2020;182(1):226-244.e17


[5]Yi H, Talmon G, Wang J. Glutamate in cancers: from metabolism to signaling. J Biomed Res. 2019;34(4):260-270


[6]Ichihara A, Koyama E. Transaminase of branched chain amino acids. I. Branched chain amino acids-alpha-ketoglutarate transaminase. J Biochem. 1966;59(2):160-9


[7]Hattori A, Tsunoda M, Konuma T, Kobayashi M, Nagy T, Glushka J. et al. Cancer progression by reprogrammed BCAA metabolism in myeloid leukaemia. Nature. 2017;545(7655):500-504

[8]T?njes M, Barbus S, Park YJ, Wang W, Schlotter M, Lindroth AM. et al. BCAT1 promotes cell proliferation through amino acid catabolism in gliomas carrying wild-type IDH1. Nat. Med. 2013;19(7):901-908


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