活體單細胞成像揭示生物鐘發(fā)育過程

PLOS Biology 期刊在線發(fā)表了題為《斑馬魚生物鐘的活體單細胞成像》的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術(shù)**創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心、神經(jīng)科學國家重點實驗室嚴軍研究組、何杰研究組與安徽醫(yī)科大學附屬**醫(yī)院教授李元海合作完成。該研究成功構(gòu)建了可以活體實時觀測斑馬魚單細胞節(jié)律的報告基因系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)研究了單細胞水平的生物鐘在發(fā)育過程中是如何建立的，進而發(fā)現(xiàn)光照在斑馬魚的單細胞生物鐘發(fā)育中的重要作用。

從單細胞生物到人，二十四小時晝夜節(jié)律（circadian rhythm）是極為普遍的生物學現(xiàn)象。生物的生理過程和行為通過生物節(jié)律與外界二十四小時光照周期同步。在分子水平上，脊椎動物的晝夜節(jié)律主要是由核心鐘基因構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路產(chǎn)生的。在組織和器官水平上，晝夜節(jié)律由核心鐘和周邊組織的鐘組成。核心鐘被普遍認為位于哺乳動物的SCN或斑馬魚的松果體， 接受光信號的輸入，然后通過神經(jīng)遞質(zhì)或激素等把節(jié)律信號傳遞到周邊組織。在成年動物體內(nèi)，絕大部分細胞都能在核心鐘的指揮下自主地產(chǎn)生節(jié)律基因的振蕩。然而，有研究表明在胚胎干細胞中，節(jié)律基因的振蕩是缺失的。這說明生物鐘的振蕩是在發(fā)育過程中逐漸建立的，但是目前尚不清楚單個細胞的鐘是如何在發(fā)育過程中建立的。斑馬魚體外受精且全身透明，非常利于活體成像研究，因此被廣泛用于動物發(fā)育研究中。很多研究表明光照對斑馬魚幼魚的生物鐘發(fā)育起著非常重要的作用。但是，外界光刺激到底是啟動了細胞內(nèi)的節(jié)律振蕩，還是僅僅同步了各細胞內(nèi)已經(jīng)存在的振蕩，一直存在著爭議。這些問題只能通過單細胞生物鐘報告基因的活體成像解決。

該研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)**次成功構(gòu)建了可以活體實時觀測單細胞節(jié)律的斑馬魚模型(nr1d1：VNP)（圖A）。他們使用雙光子顯微鏡對該熒光魚系進行了單細胞水平的發(fā)育時間點成像。在全腦水平，發(fā)現(xiàn)nr1d1：VNP報告基因的表達從松果體中的感光細胞開始，然后擴散到其它大腦區(qū)域（視頂蓋和小腦等）的細胞中（圖B，C）。通過對斑馬魚中nr1d1：VNP陽性細胞的3D重構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)nr1d1：VNP陽性細胞主要分布在松果體腔周圍，而在中部則密度較低（圖D）， 同時使用單細胞RNA-seq技術(shù)鎖定了大腦中表達nr1d1：VNP細胞的分子類型（圖E）。通過對松果體進行更高分辨率的成像，他們發(fā)現(xiàn)大部分的nr1d1：VNP陽性細胞的表達都呈現(xiàn)晝夜節(jié)律振蕩疊加在發(fā)育趨勢上的特征（圖F）。最為有趣的是，在光/暗（LD）周期下，不同細胞的nr1d1：VNP表達顯示出同步的晝夜節(jié)律振蕩。然而，在光刺激缺失的全暗（DD）環(huán)境下，細部中的nr1d1：VNP晝夜節(jié)律表達被顯著抑制，但其隨發(fā)育上升的趨勢不受影響（圖G）。這些研究結(jié)果表明，發(fā)育早期光刺激是啟動核心鐘細胞內(nèi)的24小時周期節(jié)律振蕩的重要開關。

在這項工作中，研究者**實現(xiàn)了在單細胞水平下監(jiān)測斑馬魚幼魚中晝夜節(jié)律基因的表達， 揭示了細胞中的晝夜節(jié)律在發(fā)育過程中是如何被逐步建立起來的。這種新的nr1d1：VNP節(jié)律報告魚系在晝夜節(jié)律研究中將有廣泛的應用，比如可以用于研究晝夜節(jié)律與體內(nèi)細胞周期之間的關系、可以對晝夜節(jié)律進行細胞型特異性成像、用于篩選影響晝夜節(jié)律和睡眠的藥物等。