將CRISPRCas9與納米孔測序相結(jié)合實現(xiàn)靶向測序

為了尋找對人類基因組進(jìn)行測序并讀取DNA關(guān)鍵變化的新方法，來自美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員在一項新的研究中成功地使用了基因切割工具CRISPR/Cas9在較長的腫瘤基因周圍進(jìn)行了DNA切割，以用于收集序列信息。他們在來自人類乳腺癌細(xì)胞和組織的基因組中進(jìn)行概念驗證實驗。相關(guān)研究結(jié)果近期發(fā)表在Nature Biotechnology期刊上，論文標(biāo)題為“Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation”。

這些研究人員表示，將CRISPR與對人類癌癥組織的DNA成分進(jìn)行測序的工具相結(jié)合有朝一日可能能夠?qū)崿F(xiàn)對患者腫瘤的快速、相對便宜的測序，從而簡化針對高度特異性的個人基因改變的治療方法的選擇和使用。

論文通訊作者、約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程助理教授、分子生物學(xué)與遺傳學(xué)助理教授Winston Timp博士說，“對于癌癥患者的腫瘤測序，你不一定需要對整個癌癥基因組進(jìn)行測序。對特定的遺傳感興趣區(qū)域進(jìn)行深度測序可能非常有用。”

在常規(guī)的基因組測序中，科學(xué)家們必須制造出感興趣的DNA的許多拷貝，將DNA隨機(jī)斷裂為多個片段，然后給一臺計算機(jī)機(jī)器提供這些斷裂的片段，這樣就可讀取由堿基A、C、G和T組成的核酸序列。然后，他們尋找這些斷裂片段的重疊區(qū)域，并將它們像屋頂上的瓦片一樣裝配在一起，以形成構(gòu)成一個基因的較長DNA區(qū)域。

在這些實驗中，Timp和博士生Timothy Gilpatrick能夠利用CRISPR對從乳腺癌患者的一小部分腫瘤組織中分離出來的DNA進(jìn)行靶向切割，從而能夠跳過常規(guī)測序的DNA復(fù)制部分。隨后，他們將所謂的“測序接頭（sequencing adaptor）”附著到DNA片段的CRISPR切割末端上。這些測序接頭充當(dāng)把手的作用，將DNA引導(dǎo)到讀取其堿基序列的“納米孔（nanopore）”中。通過讓DNA穿過這個狹窄的納米孔，測序儀可以根據(jù)每個化學(xué)代碼（即堿基）滑過該孔時產(chǎn)生的獨(dú)特電流來產(chǎn)生DNA堿基的讀數(shù)。

在Timp團(tuán)隊關(guān)注的10個乳腺癌基因中，這些研究人員能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞系和組織樣品進(jìn)行納米孔測序，從而檢測出一種稱為甲基化的DNA改變。甲基化指的是甲基添加到基因周圍的DNA上，從而影響基因的讀取方式。

這些研究人員在一個稱為角蛋白19（KRT19）的基因中發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化下降的位置。先前的研究已表明KRT19中DNA甲基化的減少與腫瘤擴(kuò)散有關(guān)。

在他們研究的乳腺癌細(xì)胞系中，Timp團(tuán)隊能夠?qū)崿F(xiàn)平均每個堿基對產(chǎn)生400個“讀數(shù)”，這個讀數(shù)的“深度”比某些常規(guī)測序工具好數(shù)百倍。在他們的活組織檢檢查中獲得的人類乳腺癌腫瘤組織樣本中，他們能夠?qū)崿F(xiàn)平均每個區(qū)域產(chǎn)生100個讀數(shù)。Timp說，“這肯定比我們用細(xì)胞系所能做的要少，但是我們必須對人類組織樣本中的DNA更加溫和，這是因為它已經(jīng)被冷凍和解凍了好多次。”

除了對DNA甲基化和較小突變進(jìn)行研究外，Timp團(tuán)隊還對通常與乳腺癌相關(guān)的基因--- BRCA1，這個基因在基因組中的長度超過8萬個堿基---進(jìn)行了測序。Gilpatrick說，“這個基因確實很長，我們能夠收集這個大而復(fù)雜的基因組區(qū)域的測序片段（sequencing reads）。”

Timp說：“鑒于我們能夠使用這種技術(shù)對比較長的基因進(jìn)行測序，因此我們也許能夠捕獲到缺失的較大的DNA片段，而這些都是我們無法用更常規(guī)的測序工具所能找到的。”

Timp說，除了可以為患者提供指導(dǎo)治療的潛力外，CRISPR技術(shù)與納米孔測序的結(jié)合提供了如此好的深度，以至于它可能幫助科學(xué)家們找到新的針對一個等位基因（遺傳自父本或母本）而不是另一個等位基因的疾病相關(guān)基因改變。

Timp和Gilpatrick計劃繼續(xù)完善CRISPR/納米孔測序技術(shù)，并將在其他腫瘤類型中測試它的功能。