化學限定細胞培養基的優化

化學限定細胞培養基的優化

——細胞體外培養方法中取代胎牛血清

作者：J. van der Valk, D. Brunner , K. De Smet, ?. Fex Svenningsen, P. Honegger, L. Knudsen, T. Lindl, J. Noraberg, A. Price, M.L. Scarino, G. Gstraunthaler

刊登于Toxicology in Vitro. 2010，24(4): 1053-1063

1. 背景

要使細胞存活更長時間或評估它的增殖、遷移和分化，一個基礎培養基肯定是不夠的，需要添加一些因子。血清是最常用的細胞維持和增殖的添加成分，特別是胎牛血清。然而，胎牛血清的使用也存爭議。一、使胎牛遭受痛苦。二、血清成分的批次波動。三、潛在的污染，如BSE，這使得動物源材料在新型生物藥的生產中被強烈排斥。事實上，在20%-50%的商品化FBS中存在病毒陽性。

以無血清培養基應用為主要內容的良好細胞培養實踐（Guidelines for Good Cell Culture Practice, GCCP）已發表。ECVAM科學建議委員會（ESAC）也發表了一個聲明，強烈建議使用無血清替代物。盡管實施GCCP還沒有形成法規，但GCCP已成為GLP和GMP的一部分。

一個工作坊于2003年開始啟用，討論減少細胞和組織培養中FBS使用的可能性。本次會議的報告明確建議，減少或停止未出生的用于生產FBS的牛犢的痛苦。倫理、安全性和科學根據也在會上給出，用于替代細胞和組織培養方法中的FBS。2009年又開了一次工作坊，討論了無血清培養基的現狀。工作坊在丹麥哥本哈根舉行，是在歐洲體外毒理學會（ESTIV）、荷蘭-比利時體外方法學會（INVITROM）和丹麥體外毒理學網絡贊助下組織的。本次工作坊的結果清楚地顯示了是可以開發出一些不同原代細胞和組織以及細胞系的無動物成分培養基的。而且，該會還給出了指導意見，用于開發無血清、化學限定的哺乳動物細胞和組織培養基。

2. 無血清培養基的開發

無血清培養基的開發可追溯到1955年。早期嘗試是用無血清、激素補充的培養基培養細胞，以了解血清在細胞培養基中的作用，并努力識別血清中所有與細胞增殖有關的生理成分，并用那些成分進行替代。該努力沒有成功。從那時起，幾種不同無血清制劑的配方已經出來了，培養基補充了大約十個必要成分。其成功率為10-20％。1976年，G.佐藤進行了開創性的工作，開發出一個好的化學限定無血清培養基。他通過添加特定激素來替代血清，能促進細胞生長和分化。在最近10年里，對細胞功能的研究更為深入，已能鑒定出更多成分，加入到無血清培養基中使其性能更佳。許多轉化細胞或新轉染的細胞系可以成功地在這些無血清培養基中維持生長而無需適應。并且細胞特異的培養基數量還在穩步增長。現在，有超過一百種不同的無血清培養基配方已經開發出來，并且可以購買使用，而無須自己開發。

2.1. 基礎培養基

隨著時間的推移，很明顯幾乎每種類型細胞都有自己的營養需求，因此，廣譜的細胞無血清培養基幾乎不可能。不同類型細胞具有不同受體，參與細胞的生存、生長和分化，并釋放不同的因子到環境中去。由于開發新型的無血清培養基門檻較高，下面討論一些研發策略。

建議開始新配方時，使用DMEM和Ham's F12的50:50（v / v）混合物。該配方結合了DMEM的高氨基酸含量和Ham's F-12的高營養。此外，基礎培養基必須含有一種基礎成分，即ITS添加劑（胰島素，轉鐵蛋白和硒）。胰島素，從1924年起，已是細胞培養中必不可少的，現在是培養基中最常用的激素。轉鐵蛋白也是一種培養基中的必需蛋白質，其主要作用是將鐵轉移到細胞中。硒是一種必需的微量元素，尤其在硒蛋白中起作用，它可以保護細胞免受氧化應激。

2.2. 添加劑

盡管有些細胞類型可以在基礎培養基中維持生長，但大多數細胞需要添加劑以存活、增殖或分化。大多數常見的添加成分如下：

2.2.1 激素

所有哺乳動物的激素都是血液循環中的生理成分。因此，它們也以不同的量存在于血清中。 因此，補充激素是開發無血清培養基的**步。胰島素在所有無血清培養基配方中都是必需的。 其他常用激素有糖皮質激素（地塞米松、氫化可的松）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）和能升高細胞內cAMP的細胞特異性激素。水溶性甾體激素也可用。

2.2.2 生長因子

通常將生長因子添加到基礎培養基中以增加細胞增殖和刺激特定細胞功能。 傳統上，生長因子和其他補充劑是以胎牛血清（FBS）的形式添加。大多數生長因子是高度細胞特異性的，其他的則更廣譜，可以對幾種不同的細胞類型也有陽性效應。FGF-2，例如，對無血清培養的軟骨細胞表型有陽性作用。培養的細胞有些可以釋放生長因子，刺激自身和其他細胞的增殖。

2.2.3 蛋白酶抑制劑

添加的FBS包含蛋白酶抑制劑，即α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白。蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化，并且通過抑制細胞更新時偶爾釋放的溶酶體肽酶而對細胞有益，蛋白酶抑制劑對細胞具有保護作用，但不是必需的。當沒有提供蛋白酶抑制劑時，應該仔細評估胰蛋白酶的濃度。

2.2.4蛋白質水解產物

蛋白質水解產物用于提供氨基酸和短肽。這些不是細胞培養中必不可少的成分，其效果有爭議。事實上，一些研究報告蛋白水解產物對細胞培養的有益作用，其他一些研究證明蛋白質水解產物不支持細胞生長，而且更高的濃度會減少細胞生長。蛋白質水解產物不是化學限定的成分，在可重復性和實驗的可比性上可能存在問題。

2.2.5剪切力保護劑

生物反應器和灌注培養液中的湍流導致細胞的剪切應力。 血清能保護細胞免受

這種剪切力損傷。 Pluronic F68具有類似的效果，但對于普通細胞培養不是必需的。

2.2.6 蛋白質

蛋白質是不同低分子量組分的載體，并且可以促進細胞黏附。 牛血清白蛋白通常用作脂質載體。然而，BSA來自動物，可能受到污染或包含雜質。 如今，可獲得重組蛋白，包括白蛋白用于無動物成分的細胞培養。

2.2.7 維生素

維生素由基礎培養基提供。至少有7種維生素對細胞生長和增殖至關重要：膽堿，葉酸，煙酰胺，泛酸，吡哆醛，核黃素和硫胺素。B族維生素是細胞生物化學所必需的，并且也存在于DMEM以及Ham F-12中。

2.2.8.氨基酸

培養哺乳動物細胞，至少13種氨基酸是必需的，即Arg，Cys，Gln，

His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Thr，Trp，Tyr，Val）并且在DMEM中以高濃度存在（0.5-4mM）。 7種非必需氨基酸（Ala，Asn，Asp，Glu，Gly，Pro，Ser）是在Ham's F-12中提供。

2.2.9谷氨酰胺

谷氨酰胺是蛋白質和核糖核苷酸合成的必需前體。它也是用于細胞快速分裂和利用葡萄糖不佳的細胞的重要呼吸燃料。然而，谷氨酰胺也有它的缺點：在溶液中不穩定，谷氨酰胺分解和代謝導致對細胞有毒的氨的產生和積累，因為氨不被無血清和/或無蛋白培養基中的血清蛋白所吸附。要克服這些缺點，人們又開發了在培養基中使用谷氨酰胺的替代方案。例如，在表達足量谷氨酰胺合成酶的細胞中，谷氨酸可以代替谷氨酰胺。最近的一項發明是使用含有谷氨酰胺的二肽，即丙氨酰-谷氨酰胺和甘氨酰-谷氨酰胺，商品名為GLUTAMAX?。這些二肽更穩定

和耐熱，甚至可以對含有這些物質的培養基進行高壓滅菌。二肽被細胞內或細胞外的肽酶裂解，從而釋放谷氨酰胺和丙氨酸或甘氨酸。因此，谷氨酰胺的可獲得性取決于肽酶活性，這導致較低速率的的谷氨酰胺消耗和氨生產。 GLUTAMAX?可以1：1的摩爾濃度代替谷氨酰胺。

2.2.10微量元素

大多數微量元素都可以在基礎培養基中獲得。Ham's F-12富含必要的微量元素。

2.2.11 脂類

脂肪酸和脂質在細胞培養中的作用長期以來被忽視。脂質可作為能量儲備，作為細胞膜的結構成分，以及在運輸和信號傳導中扮演角色。 一些脂質可在基礎培養基中獲得。但是，建議必需脂肪酸和乙醇胺為添加劑。水溶性添加劑可商品化獲得。血清白蛋白是脂肪酸和脂質的載體。必需脂肪酸是幾種無血清培養基配方的組分。

2.2.12 抗生素

應盡可能避免使用抗生素。可能會產生耐抗生素的微生物，抗生素對細胞生長和功能也可能有不良影響。

2.2.13黏附因子

大多數哺乳動物細胞需要用于細胞粘附的特殊的培養基質才能在體外存活和生長。塑料培養皿，經過特殊處理后在聚苯乙烯表面引入電荷和親水性，例如多聚L（或D）-賴氨酸或鳥氨酸，是最常用的細胞黏附基質。培養平皿上包被其他基質如細胞外基質成分或膠原蛋白基質，可進一步促進貼壁細胞的黏附。

2.2.14滲透壓

盡管哺乳動物細胞表現出對滲透壓一定的耐受，滲透壓仍應始終仔細檢查，并且

在適應新的細胞基配方時，應對滲透壓進行補償。

2.3 開發一種無血清培養基

如上所示，要從細胞和組織培養基中去除FBS，并仍然保持細胞粘附、生長和增殖，很重要的是要包括幾種細胞培養基中的組分（需大量）。圖中1顯示的是一個“培養基金字塔”。金字塔的底部為基礎培養基，包括DMEM / Ham's F-12（50：50，v/v），添加有胰島素-轉鐵蛋白-硒（ITS）。要使貼壁細胞黏附在培養容器底物，應考慮包被細胞外基質的成分。細胞無血清培養通常需要細胞黏附因子。

培養基配方開發的下一步是添加特定的激素和生長因子。表皮生長因子（EGF）和糖皮質激素（氫化可的松、地塞米松）應在大多數培養基中存在。根據細胞類型，還可能需要額外的細胞特異性生長因子，例如神經元所需的神經生長因子（NGF）。已經證明上皮細胞培養時需要添加升高細胞內cAMP水平激動劑。在這方面，毛喉素和霍亂毒素，盡管是強藥劑，被用作體外有絲分裂原。

金字塔頂端代表無血清培養基成分的特異性增加：即添加有脂質，抗氧化劑和/或特定維生素。維甲酸（維生素A）是一些上皮類型細胞所需的添加劑。維生素E（α-生育酚）和抗壞血酸（維生素C）被看作抗氧化劑。其他無血清培養基中的抗氧化劑有β-巰基乙醇（β-ME）和硒（見上文）。

圖1. 開發無血清培養基的金字塔

2.4 細胞系對無血清培養基的適應

有如下幾種方法：

1. 逐步減少血清用量，直到血清比例為0.1%

2. 含血清培養基與無血清培養基比例的變化

3. 和方法2相似，只不過采用比例逐漸降低的條件培養基

4. 接種的細胞已實現馴化好

3. 促進無血清培養基的開發和應用

3.1 信息來源

在自我開發之前，應先查查數據庫，是是否有已經開發好的。市面上現已有450種不同無血清培養基，但只針對有限的細胞類型。

3.2 無血清培養基互動在線數據庫

3.3 驗證新的培養基和適應的細胞

在關于使用FBS和其他動物源性添加劑的聲明中（ESAC，2008），ECVAM科學咨詢委員會強烈主張開發新的無血清體外培養方法。此外，如體外使用含血清的培養方法，將培養基提交給ECVAM進行驗證，必須提供使用血清的理由。

為了促進無血清培養基的使用，ECVAM（替代方法的歐洲驗證中心）將鼓勵無血清培養體系驗證的提交者公開他們的無血清方案。已有的替代動物成分的培養方法，應同含血清的培養基進行比較，確保觀察終點不受影響。

ECVAM網站 (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu)有一個關于無血清培養基的公開論壇。

3.4 其他活動

希望優先使用無血清培養基的資助機構可以提供促進FBS替代品的激勵措施。關于體外培養和工藝的研討會和會議，還應鼓勵開展特定研討會和海報，交流與無血清培養基有關的經驗。研討會可以由細胞和組織培養學會（例如ESTIV）的工作組籌備。此外，應開展無血清細胞和組織培養價值的教育，他們也是基礎培養技術教育和培訓的一部分。

支持協調行動，促進與特定細胞和組織培養相關的信息交流，可以在國家，歐洲和國際層面進行。

4. 無血清研究舉例

4.1 血小板裂解物

下面報道了使用人血小板裂解物（PL）作為血清替代物。PL是由保存的人供體血小板濃縮物制備。在低滲鹽水中凍融可實現血小板的**活化。血小板顆粒生長因子的釋放程度可通過ELISA和Western Blotting測定。PL的生長促進能力和促有絲分裂能力，可在眾多有選擇的連續細胞系上進行測試，這些細胞系的生長特征、表型和分化終點應已很好地確定。 PL+DMEM支持細胞的生長、增殖和分化，通過穹頂形成評估近端小管樣LLC-PK 1（豬腎）和HK-2（人腎）細胞，而遠端小管樣MDCK（狗腎）細胞在血小板提取物添加的無血清DMEM / Ham-F-12中生長良好。除貼壁上皮細胞系外，不依賴貼壁的Raji人淋巴瘤細胞也進行了研究。 PL完全支持懸浮Raji細胞的生長和增殖。在所有細胞系中，監測增殖是通過確定上皮培養物的細胞密度（每個生長區域的細胞數）來確定，以及刃天青或WST-8測定。生長率和增殖率在含10％FBS或5％PL的培養基條件下，二者相當。為了確定PL的促增殖潛力，細胞外MAPK（ERK1 / 2）的刺激進行了檢測。GR激活MAPK信號通路，使下游ERK1/2磷酸化。將PL添加到靜止狀態的LLC-PK1培養物中，幾分鐘內即可發生ERK1/2的磷酸化和激活。FBS對應的ERK1/2活化的時程相同。數據顯示，在哺乳動物細胞和組織培養中，PL替代FBS是有價值的，具有高潛力。

4.2無血清聚集腦細胞培養物

涉及腦細胞的3D培養，這里略。

4.3器官型腦切片培養和化學限定的無血清培養基 Neurobasal與B27

器官型腦切片培養可以生長數周和數月，保留其基礎細胞結構、組成和連接，并越來越多地用作研究神經退行性疾病機理和治療的模型。在1990年代中期，含25％馬血清的Optimem培養基被無血清的Neurobasal和B27添加劑所替代。

細胞起始是在Serum Optimem培養2天，之后即用無血清培養，旨在避免未知生長因子和血清批間差異的影響。含B27的Neurobasal的使用效果很好，直到2000年初發現培養物種的壞死洞。2010年，一個美國小組公布了N21的配方，它是對B27配方的優化。Sigma-Aldrich也在2010年初推出一系列神經元和干細胞的完全培養基，Stemline TM，其中包含了所有必需的添加劑，可和Serum Optimem進行比較。

4.4 化學限定培養基和血清培養基有時誘導細胞采用不同信號轉導通路進行增殖

含B27的Neurobasal培養基為化學限定培養基，可長期培養神經元，而成纖維細胞或星型細胞不過度生長。然而，采用該培養基原代培養有時會產生不一致的結果。例如，一些膠質細胞和神經元生長所采用的信號通路，會與在血清培養基中生長不一樣。

4.5 人小腸細胞Caco-2在無血清培養基中功能分化所需培養條件的優化

雖然人Caco-2細胞系代表了**和最廣泛使用的可吸收腸道細胞模型，該細胞分化功能仍顯示出高度的異質性，這主要由于培養流程的不同。胎牛血清（FBS）是產生變異的重要來源。因此多年來已經使用無血清培養基培養這些細胞。Halleux和Schneider于1991年開發出一種用于Caco-2細胞的無血清培養基，它改進自肝細胞的營養培養基，添加有胰島素，表皮生長因子，白蛋白-亞麻酸，氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸（T3）。細胞生長在包被有膠原蛋白的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）濾膜上，作為腸道屏障的模型。并在培養15天后顯示出腸細胞的許多分化功能，正確的極化和細胞側壁通透性的降低，表明建立了有正常功能的緊密連接。不久之后，Jumarie和Malo獲得了接種在塑料基質上、采用ITS添加的DMEM培養的分化的Caco-2細胞。該限定培養基可是使細胞3周后正常分化，僅有蔗糖酶活性低于血清培養的細胞，但可加入T3提高其活性。

一種包含ITS和脂質的無血清培養基被用于分化Caco-2細胞。為提高該培養基性能，試驗了一些不同的添加劑，（A）胰島素，轉鐵蛋白，硒（ITS）和脂質混合物（油酸鹽，棕櫚酸鹽，膽固醇和BSA作為載體）; （B）來自ITS的生長因子和激素的成分限定的混合物。

5.結論

使用血清培養細胞和組織是有問題的，它同時存在有倫理和科學的原因。因而推薦使用無血清培養基，并且**是無動物成分和化學限定的培養基。

因此建議采用"不，除非”的原則，即不使用血清，除非還沒開發出無血清培養基。開發無血清培養基，一些成分是必需的哦，另一些則是有用的。而且采用了一些方法使細胞適應新的無血清培養基。

對于新的血清的驗證要注意，應使原先研究的標志物在細胞和組織上仍然表達。現在已經有了成功地開發無血清培養基的方法，文中的模型顯示，開發并不是一項容易的任務，還存在一些問題。通過數據庫、會議和網絡寫作，廣泛的交流有助于開發出新的無血清培養基配方。

附錄

開發無血清培養基的建議

1.開發無FBS培養基時，從適當的基礎培養基開始。50:50（v/v）DMEM和Ham's F-12和ITS是一些研究成功的選擇。

2.當使用谷氨酰胺時，應加入濃度為2-4mM的谷氨酰胺。也對于一些細胞系，也可以添加Glutamax I TM（L-Ala-L-Gln）。

3.必要時補充細胞類型特異性的生長因子，激素，維生素，微量元素和脂質。

4.注意滲透壓。

5.對于某些研究或細胞類型，可以添加特定蛋白質。

6.有些必需脂肪酸，不存在于基礎培養基中，可能需要添加。

7.**不使用抗生素。

8.對于一些細胞類型和原代培養，可以使用黏附基質。許多無血清配方需要預先包被培養皿。

9.對于生物反應器和灌注培養，可以添加剪切力保護劑（Pluronics F68）。

10.細胞馴化應小心進行。

11.始終檢查細胞的性能是否發生了變化，以及研究終點是否受到影響。

12.成功后，與同事和通過現有細胞培養數據庫分享你的配方。