有源CRISPR酶的**個(gè)高分辨率圖像將有助于改善基因組編輯

有史以來**次，科學(xué)家們正在努力解決如何提高CRISPR技術(shù)的效率 - 一種基因編輯平臺(tái)，它使用一種名為Cas9的酶來精確切割和編輯活細(xì)胞內(nèi)特定的DNA序列 - 已經(jīng)捕獲了原子級(jí)，切割DNA之前和之后酶的三維圖像。

這些圖像提供了關(guān)于酶如何工作的新結(jié)構(gòu)信息，并將幫助研究人員開發(fā)能夠更有效和精確地改變靶基因的酶的修飾版本。Cas9的圖像和見解由它們制成，發(fā)表在Nature Structural and Molecular Biology上。

CRISPR是一種基因編輯工具，允許科學(xué)家從DNA中切除不需要的基因或遺傳物質(zhì)，或在基因中添加所需的序列以改變其功能或調(diào)節(jié)其活性。CRISPR使用一種名為Cas9的酶，它像剪刀一樣切割特定的DNA序列。一旦在DNA的任一側(cè)進(jìn)行切割，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)修復(fù)系統(tǒng)，將DNA鏈的兩端重新連接在一起。

“阻止使用Cas9開發(fā)更好的基因編輯工具的主要障礙之一是我們?cè)谇懈頓NA后沒有任何酶的圖像，并且沒有關(guān)于這種非常重要的酶經(jīng)歷執(zhí)行的變化的完整信息。反應(yīng)，“伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校生物化學(xué)與分子遺傳學(xué)副教授，該論文的通訊作者M(jìn)iljan Simonovic說。

早期的Cas9結(jié)構(gòu)圖像已經(jīng)使用X射線晶體學(xué)獲得，但這種方法具有局限性。為了捕獲結(jié)晶形式的酶的各種狀態(tài)，研究人員使用無活性的Cas9(一種不切割DNA的酶)或在不支持DNA切割的條件下形成晶體。這些過程只能在切割之前產(chǎn)生酶的圖像。

西蒙諾維奇說：“對(duì)調(diào)節(jié)Cas9活性感興趣的研究人員或可能工作得更好的工程突變酶只是開始時(shí)沒有完整的信息，因此進(jìn)展并不像預(yù)期的那么快。”“但現(xiàn)在我們有了更清晰的圖像，我們甚至可以看到酶的主要結(jié)構(gòu)域在反應(yīng)過程中如何移動(dòng)，這對(duì)于進(jìn)一步探索可能很重要。”

該研究的共同資深作者，不列顛哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)教授Sriram Subramaniam表示，能夠看到Cas9如何在如此高水平的細(xì)節(jié)上切割和編輯DNA鏈?zhǔn)呛芰钊伺d奮的。“這些圖像為我們提供了寶貴的信息，可以提高基因編輯過程的效率，從而有望在未來更快，更準(zhǔn)確地糾正導(dǎo)致疾病的DNA突變。”

Simonovic知道需要一種不同的成像技術(shù)才能真正看到Cas9在工作。在過去十年中，低溫電子顯微鏡或低溫EM已經(jīng)因其在接近其自然環(huán)境的條件下以高分辨率成像大分子的能力而眾所周知。

Simonovic和他的同事使用活性Cas9以及DNA和指導(dǎo)RNA。加入激活酶以進(jìn)行DNA切割所需的鎂，并快速冷凍Cas9復(fù)合物并使用cryo-EM成像。最終結(jié)果是Cas9捕獲在與核酸結(jié)合的三種不同結(jié)構(gòu)排列中的快照。最值得注意的是，在三種狀態(tài)中的兩種中，靶DNA被切割但酶仍然與其結(jié)合，從而允許以高分辨率觀察生化反應(yīng)序列的最后一步。

在**種狀態(tài)下，在切割DNA之前捕獲酶，其主要結(jié)構(gòu)域“評(píng)估”待切割的序列是否合適。在第二步中，Cas9幾乎在DNA切割后立即成像。實(shí)際上，酶的活性位點(diǎn)懸停在DNA鏈的切割之上。并且，在第三種狀態(tài)下，酶開始向離開切割的DNA移動(dòng)。

“我們發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)關(guān)于Cas9如何與DNA相互作用以及它如何運(yùn)作的新事物。其中一個(gè)最有趣的問題是，在反應(yīng)過程中，幾個(gè)酶結(jié)構(gòu)域如何協(xié)同運(yùn)動(dòng)并在有序狀態(tài)和無序狀態(tài)之間循環(huán)。這種酶的特征是某些結(jié)構(gòu)域是西蒙諾維奇表示，穩(wěn)定而其他人似乎正處于不同的構(gòu)造狀態(tài)之間快速移動(dòng)之前，之前沒有看到或預(yù)測(cè)過。“這些新信息可用于調(diào)節(jié)Cas9如何處理靶向DNA，并有助于設(shè)計(jì)更好的基因組編輯工具。”