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新的CRISPR平臺(tái)擴(kuò)展了RNA編輯功能

2019-07-15 11:22來(lái)源:生物幫


基于CRISPR的工具徹底改變了我們靶向與疾病相關(guān)的基因突變的能力。CRISPR技術(shù)包括一系列可以操縱基因及其表達(dá)的工具,包括用Cas9和Cas12酶靶向DNA,用酶Cas13靶向RNA。該系列提供了解決突變的不同策略。靶向與疾病相關(guān)的RNA突變相對(duì)較短,可避免對(duì)基因組進(jìn)行**性改變。此外,使用CRISPR / Cas9介導(dǎo)的編輯難以編輯某些細(xì)胞類型,例如神經(jīng)元,并且需要新策略來(lái)治療影響大腦的破壞性疾病。


麻省理工學(xué)院麥戈文研究所和博士研究所以及哈佛大學(xué)核心成員馮章及其團(tuán)隊(duì)現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出一種名為RESCUE(特定C到U交換的RNA編輯)的策略,在“ 科學(xué) ”雜志上有所描述。


張和他的團(tuán)隊(duì),包括**位合作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg(現(xiàn)在都是McGovern研究員),利用一種失活的Cas13來(lái)指導(dǎo)RESCUE在RNA轉(zhuǎn)錄物上靶向胞嘧啶堿基,并使用一種新的,進(jìn)化的可編程酶進(jìn)行轉(zhuǎn)換不需要的胞嘧啶進(jìn)入尿苷 - 從而指導(dǎo)RNA指令的改變。RESCUE建立在REPAIR的基礎(chǔ)之上,這是由Zhang的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種技術(shù),可將腺嘌呤堿基轉(zhuǎn)化為RNA中的肌苷。


RESCUE顯著擴(kuò)展了CRISPR工具可以定位的范圍,包括蛋白質(zhì)中可修飾的位置,例如磷酸化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)活性的開(kāi)/關(guān)開(kāi)關(guān),特別是在信號(hào)分子和癌癥相關(guān)途徑中發(fā)現(xiàn)。


“為了治療導(dǎo)致疾病的遺傳變化的多樣性,我們需要一系列精確的技術(shù)可供選擇。通過(guò)開(kāi)發(fā)這種新酶并將其與CRISPR的可編程性和精確性相結(jié)合,我們能夠填補(bǔ)工具箱中的關(guān)鍵空白“麻省理工學(xué)院的James和Patricia Poitras神經(jīng)科學(xué)教授張說(shuō)。張先生在麻省理工學(xué)院腦與認(rèn)知科學(xué)與生物工程系任職。


將RNA編輯的范圍擴(kuò)展到新目標(biāo)


先前開(kāi)發(fā)的REPAIR平臺(tái)使用RNA靶向CRISPR / Cas13將RNA編輯器的活性結(jié)構(gòu)域ADAR2引導(dǎo)至特定的RNA轉(zhuǎn)錄物,其中它可以將核苷酸堿基腺嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷,或?qū)⒆帜窤轉(zhuǎn)換為I.張和同事們REPAIR融合并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)化,直到它可以將胞嘧啶改為尿苷,或C至U.


可以將RESCUE引導(dǎo)至任何選擇的RNA,然后通過(guò)平臺(tái)的演化ADAR2組件執(zhí)行C-to-U編輯。該團(tuán)隊(duì)將新平臺(tái)帶入人體細(xì)胞,顯示它們可以靶向細(xì)胞中的天然RNA,以及合成RNA中的24個(gè)臨床相關(guān)突變。然后,他們進(jìn)一步優(yōu)化了RESCUE以減少脫靶編輯,同時(shí)最小程度地破壞了目標(biāo)編輯。


新目標(biāo)即將到來(lái)


通過(guò)RESCUE擴(kuò)展靶向意味著通過(guò)翻譯后修飾(例如磷酸化,糖基化和甲基化)調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)的活性和功能的位點(diǎn)現(xiàn)在可以更容易地進(jìn)行編輯。


RNA編輯的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是其可逆性,與DNA水平的變化相反,后者是**性的。因此,RESCUE可以暫時(shí)部署在可能需要臨時(shí)修改但不是**修改的情況下。為了證明這一點(diǎn),該團(tuán)隊(duì)表明,在人類細(xì)胞中,RESCUE可以靶向編碼β-連環(huán)蛋白的RNA中的特定位點(diǎn),已知其在蛋白質(zhì)產(chǎn)物上被磷酸化,導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白活化和細(xì)胞生長(zhǎng)的暫時(shí)增加。如果這種變化是**性的,它可能使細(xì)胞易于發(fā)生不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)和癌癥,但通過(guò)使用RESCUE,瞬時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)可能會(huì)刺激傷口愈合以應(yīng)對(duì)急性損傷。


研究人員還針對(duì)致病基因變體APOE4 。APOE4等位基因一直是晚發(fā)性阿爾茨海默病發(fā)展的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。同種型APOE4與APOE2不同,APOE2不是風(fēng)險(xiǎn)因素,只有兩個(gè)差異(APOE4中的C與APOE2中的U)。Zhang及其同事將風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的APOE4 RNA引入細(xì)胞,并顯示RESCUE可將其特征性Cs轉(zhuǎn)換為APOE2序列,從而將風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化為非風(fēng)險(xiǎn)變異。


為了促進(jìn)將RESCUE推向診所的額外工作,以及使研究人員能夠使用RESCUE作為更好地了解引起疾病的突變的工具,張實(shí)驗(yàn)室計(jì)劃廣泛分享RESCUE系統(tǒng),因?yàn)樗鼈兣c先前開(kāi)發(fā)的CRISPR工具一樣。該技術(shù)將通過(guò)非營(yíng)利性質(zhì)粒庫(kù)Addgene免費(fèi)提供給學(xué)術(shù)研究