食品單增李斯特菌的特異性檢測(cè)

李斯特菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，包含有6種，但只有單核細(xì)胞增生李斯特菌導(dǎo)致人類疾病（具有高致死率），而伊氏李斯特菌只與其他哺乳動(dòng)物疾病相關(guān)。

單核細(xì)胞增生李斯特菌已在食品、環(huán)境和臨床樣本中被發(fā)現(xiàn)。其檢測(cè)方法為培養(yǎng)法，在我國(guó)食品安全國(guó)標(biāo)中有詳細(xì)的描述。該方法靈敏度高，堪稱為金標(biāo)準(zhǔn)。從樣本收集開(kāi)始，對(duì)于陰性結(jié)果的得出，通常需要3-4天，陽(yáng)性結(jié)果通常需要5-7天。對(duì)于食品企業(yè)，則希望檢測(cè)結(jié)果能更快出來(lái)。

食品單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)，受到如下這幾個(gè)因素的影響：即競(jìng)爭(zhēng)菌群的干擾、目標(biāo)菌滴度較低，以及食品成分所帶來(lái)的抑制和干擾。因此，以抗體和分子手段為基礎(chǔ)的方法也開(kāi)發(fā)出來(lái)，大部分具有同等的靈敏度，但更快，同時(shí)在48h內(nèi)能完成檢測(cè)。

然而，在選擇方法時(shí)要注意，大部分檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分不同的李斯特菌物種。在不同的李斯特菌物種中，只有單增李斯特菌是人類的病原菌，因此需要采用物種特異的方法。同時(shí)，也應(yīng)注意，并不是所有的單增李斯特菌菌株都導(dǎo)致人類疾病。在13種單增李斯特菌的血清型中，只有3種即1/2a，1/2b和4b導(dǎo)致90%以上的人類病例。

表1.實(shí)驗(yàn)室鑒別單增李斯特菌的主要試驗(yàn)

在傳統(tǒng)培養(yǎng)法中，**步是增菌。增菌的作用是提高分離的靈敏度，使得25g食品樣品中即使有1個(gè)李斯特菌也能被檢測(cè)出來(lái)。該增菌過(guò)程是選擇性的，即抑制無(wú)關(guān)菌群生長(zhǎng)。其選擇因子包括吖啶黃（抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)）、萘啶酸（抑制革蘭氏陰性菌）和放線菌酮（一種真核生物蛋白抑制劑，用于抑制真菌生長(zhǎng)）。其他抗生素包括頭孢他啶和拉氧頭孢和氯化鋰。李斯特菌分離培養(yǎng)基有的還有七葉苷，因?yàn)槔钏固鼐鷮倬哂惺蛊呷~苷水解的特征反應(yīng)。

顯色培養(yǎng)基提供了一種簡(jiǎn)便的分離鑒定李斯特菌和單增李斯特菌的方法。它主要根據(jù)李斯特菌所含有的特異酶以及特定的糖發(fā)酵反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的。通過(guò)采用李斯特菌顯色培養(yǎng)基，單增李斯特菌有可能在24h后得到初步鑒定，而之前的Oxford培養(yǎng)基等傳統(tǒng)型培養(yǎng)法則需要3-4天。顯色培養(yǎng)基也適合大部分的食品類型。

毒力基因plcA，在單增李斯特、伊氏李斯特和斯氏李斯特菌中均存在，它編碼磷脂酰肌醇磷脂酶C（PIPL-C），它常用于鑒別溶血性李斯特菌和非溶血性李斯特菌。L--磷脂酰肌醇（PI）被PIPL-C裂解產(chǎn)生不溶于水的脂肪酸，在溶血性李斯特菌菌落周?chē)纬刹煌该鞯陌咨珪灜h(huán)。它和β-D-葡萄糖苷酶一起，構(gòu)成了ALOA李斯特菌分離顯色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)（下圖）。在該培養(yǎng)基中，只有單增與伊氏李斯特菌有白色暈環(huán)。

圖. HiMedia公司生產(chǎn)的李斯特菌顯色培養(yǎng)基（ALOA法）（貨號(hào)MV1540）

可疑菌落應(yīng)進(jìn)行鑒定，如革蘭氏陽(yáng)性染色，無(wú)芽孢桿菌，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，28℃存在動(dòng)力，37℃不存在動(dòng)力。

生化鑒定試劑盒可進(jìn)一步鑒定李斯特菌的物種。HiMedia提供了2款李斯特菌物種生化鑒定試劑盒（貨號(hào)分別為KB012A，KBM003A，下圖）。鑒定卡上包含了12個(gè)迷你生化反應(yīng)，囊括了經(jīng)典的生化鑒定試驗(yàn)。KBM003A多出動(dòng)力學(xué)鑒定試驗(yàn)。

HiMedia公司生產(chǎn)的HiBio-ID菌種生化鑒定試劑盒

致病李斯特菌和非致病李斯特菌可通過(guò)它們的溶血反應(yīng)或PIPL-C活性來(lái)鑒別。溶血反應(yīng)是鑒別單增李斯特（溶血）和英諾克李斯特菌（不溶血）的常用試驗(yàn)。PIPL-C活性則可通過(guò)顯色培養(yǎng)基檢測(cè)。木糖和鼠李糖發(fā)酵則可將單增李斯特與伊氏李斯特和斯氏李斯特區(qū)分開(kāi)來(lái)，單增是木糖（—）鼠李糖（+），伊氏和斯氏是木糖（+）鼠李糖（-）。丙氨酸肽酶是所有李斯特物種具有、唯獨(dú)單增李斯特菌不具有的一種酶，也可用于物種鑒別。

對(duì)于其他檢測(cè)方法，為保證靈敏度，仍然需要增菌。免疫法檢測(cè)閾限較高，而核酸擴(kuò)增法更為靈敏，但PCR反應(yīng)容易被食品中的成分所抑制，并且不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。增菌可以稀釋那些抑制成分，并且使檢測(cè)的核酸是來(lái)自生長(zhǎng)的細(xì)胞。核酸法的特異性更強(qiáng)，并且速度也較快，并以qPCR定性為主。

在采用新檢測(cè)方法之前，有必要對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。在國(guó)際上，ISO和AOAC的標(biāo)準(zhǔn)可以參考。

HiMedia公司是國(guó)際知名微生物產(chǎn)品生產(chǎn)商，一直致力于微生物培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基的研發(fā)和生產(chǎn)，其顯色培養(yǎng)基有80多種，涵蓋各個(gè)領(lǐng)域，包括無(wú)動(dòng)物源成分及化學(xué)限定的，并具有WHO GMP認(rèn)證、ISO9001：2008，ISO13485：2003認(rèn)證，CE認(rèn)證和FDA注冊(cè)登記。其產(chǎn)品行銷全球140多個(gè)國(guó)家。

締一生物作為HiMedia公司在中國(guó)的代理商，在微生物培養(yǎng)和檢測(cè)領(lǐng)域，一如既往地為您帶來(lái)優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。如需詳細(xì)了解，可訪問(wèn)公司官網(wǎng)：

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