經過CRISPR編輯的B細胞產生抗體，對抗難以治療的病毒

疫苗每年可以預防數百萬人死亡，并將某些疾病推向了生存的邊緣。然而，事實證明，開發針對多種病毒的有效疫苗即使不是不可能，也具有極大的挑戰性。

盡管進行了數十年的研究，但尚未有得到批準的疫苗能夠長期預防流感病毒、愛潑斯坦巴爾病毒（EBV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。比如，對作為一種引起呼吸道感染的病原體的RSV而言，高風險嬰兒每月接受合成抗體注射，以便在短期內保護這些嬰兒。

近年來，幾組研究人員探索了一種不同的方法：利用免疫系統自身產生抗體的B細胞，并利用CRISPR對它們進行改造，以便在感染的情況下按要求大量表達針對這些難以治療的病毒的抗體。

在一項新的研究中，來自美國弗雷德哈欽森癌癥研究中心和華盛頓大學的研究人員通過這樣做，成功地對人類和小鼠B細胞進行基因修飾來表達靶向HIV、EBV、流感病毒和RSV的抗體。他們還證實這些經過基因改造的B細胞在小鼠感染模型中阻止RSV感染。相關研究結果發表在2019年5月17日的Science Immunology期刊上，論文標題為“B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection”。

美國明尼蘇達大學基因組工程師Branden Moriarity（未參與這項新的研究）說道，“這是一項非常好的研究。這是人們長期以來一直在思考的概念?！?/span>

為了對B細胞進行修飾，弗雷德哈欽森癌癥研究中心免疫學家Justin Taylor和他的團隊探究了在之前研究中經證實有效對抗這四種病毒中的每一種的抗體。他們使用一種常規的CRISPR策略將編碼抗體的DNA插入到在原代人B細胞的抗體編碼基因上產生的小切口中。

這些研究人員設計了這種插入，使得新抗體蛋白的表達受到這些細胞自身啟動子的調節，從而允許這些細胞能夠像正常那樣在經受病毒抗原觸發后產生它們。他們將盡可能多地讓這些經過修飾的B細胞分化為分泌抗體的血漿B細胞，這些血漿B細胞在它們的細胞表面上表達這些抗體并分泌它們。

一旦這些研究人員證實這些經過修飾的B細胞中的一個合理比例確實表達這些新抗體，他們就會研究這些細胞是否在小鼠中抵抗病毒感染。他們在小鼠B細胞中重復了這個過程，誘導它們表達靶向RSV的抗體，將成功修飾的B細胞群體灌注到正常的嚙齒動物中，然后等待一段時間。

六天后，RSV特異性抗體出現在它們的血清中，但沒有出現在對照小鼠中。這些小鼠中的一些動物接受鼻內劑量的RSV注射，這些經過修飾的B細胞成功地抵抗這種病毒。五天之后，這些研究人員幾乎沒有在血液中含有這些經過修飾的B細胞的小鼠肺部中檢測到任何水平的RSV，但是他們在不含有這些B細胞的對照小鼠中發現了高水平的這種病毒。

Taylor說，他認為這些經過修飾的B細胞可能對經歷過造血干細胞移植的患者有用。這些患者通常服用了免疫抑制劑，非常容易受到病毒感染。這些患者遭受的RSV感染能夠通過諸接受如帕利珠單抗之類的合成抗體注射來阻止，但是必須定期接受這種注射。另一方面，經過改造的B細胞理論上僅需注射一次。

為了研究經過改造的B細胞是否可能在這種情況下提供保護，這些研究人員研究了缺乏T細胞和B細胞的突變小鼠。在他們將這些細胞注入到這些突變小鼠中后，他們吃驚地發現與野生型小鼠相比，這些突變小鼠中的RSV特異性抗體似乎在血液中停留更長時間。事實上，免疫缺陷小鼠在接受這些經過改造的B細胞移植82天后就能夠預防RSV感染。Taylor解釋道，為何會這樣是“我們需要更多探索的東西”。

總的來說，Taylor團隊采用的方法類似于近期其他研究所采用的方法，比如發表在eLife期刊上的一項研究（eLife, 2019, doi:10.7554/eLife.42995）和發表在Journal of Experimental Medicine期刊上的一項研究（Journal of Experimental Medicine, 2019, doi:10.1084/jem.20190287），這兩者都使用CRISPR來構建表達HIV中和抗體的B細胞。但是不同之處在于，當前的這項新的研究解決了對抗體編碼基因進行改造的過程中的一些關鍵難題。

這是件棘手的事情：首先，抗體是由兩個基因合成的---一個基因用于編碼抗體的重鏈，一個基因用于編碼抗體的輕鏈。一旦重鏈和輕鏈分別翻譯成蛋白，它們就會融合在一起形成最終的抗體。對這些基因進行編輯所面臨的挑戰在于錯配有時可能會發生，從而導致由經過改造的重鏈與B細胞自身的輕鏈配對在一起組成的雜合抗體。在某些情況下，這可能會導致自身免疫反應。Taylor解釋道，“這種風險很低. . .但是，鑒于幾百萬個B細胞有數百萬個獨特的輕鏈，這個風險不值得冒。”

Taylor團隊通過將編碼重鏈和輕鏈的DNA在物理上連接在一起并將連接后的DNA插入到單個CRISPR切割位點中來解決這個問題。（其他的研究小組已設計出不同的策略來解決這個問題，比如，敲除B細胞自身的輕鏈編碼基因。）

美國西雅圖兒童研究所免疫學家Richard James（未參與這項新的研究）評論道，“我認為他們用來將輕鏈和重鏈融合在一起的基因改造策略是一個很好的想法，這很不錯?！?/span>

然而，他補充道，“在實踐中，這將是一種昂貴的療法”，并指出個性化的CAR-T細胞療法已被認為花費接近50萬美元。就目前而言，B細胞療法必須是個性化的：鑒于這些細胞表達個體特異性的細胞表面抗原，來自一個供者的細胞在不同的受者中會遭受免疫排斥。他補充道，“除非我們能找到構建同種異體B細胞的方法，只有這樣才會變得更具成本效益?！?/span>

Moriarity同意這一點。他說，“只有當你患者一種你將死于的疾病而且真地沒有其他的治療方法時”，預防性地使用經過改造的B細胞可能只是一種可行的治療選擇。不過，他說，這項新的研究為未來的研究提供了其他的可能性，而且也是最早在小鼠B細胞中對抗體進行改造的研究之一。對于研究B細胞分化和細胞與免疫相關過程的科學家來說，“我認為這將對基礎生物學領域做出巨大貢獻”。

曾是哈佛大學免疫工程師如今是免疫治療創業公司STIMIT首席執行官的Michael Goldberg認為這項新的研究是“之前研究的一個很好的延伸”。對他來說，B細胞抗體改造除了能預防病毒感染外，還具有其他優勢：比如，具有對血液中抗原濃度作出反應的抗體水平可能可用于治療諸如類風濕性關節炎之類的疾病，其中類風濕性關節炎通常用中和細胞因子TNFα的抗體加以治療。

然而，“抗體表達的持續時間需要增加。在這方面，加強我們對移植過程和B細胞培養條件的理解將是重要的。盡管如此，鑒于這些是**批涉及對經過改造的B細胞進行過繼性轉移的實驗，初步結果令人鼓舞。”

Taylor同意仍有更多的研究工作需要開展。他說，“我們在這項研究中完全忽略的一件事是真正評估我們正在做的事情的安全性，確保沒有任何脫靶效應發生，我認為這一直是人們針對CRISPR-Cas9所關心的一個問題。在用于人體治療之前，我們必須絕對確定它是安全的。”