藥品檢驗用培養基的驗證

當一種品牌的培養基在某藥廠開始啟用的時候，一般先需要進行驗證。下面根據《中國藥典》2015年版，對驗證方法進行闡述。

一：無菌檢查

全過程應無菌操作。環境的潔凈度應符合無菌檢查的要求。

對無菌檢查用培養基的要求：干粉培養基加純水溶解并高壓滅菌后，溶液應澄清，無沉淀。

培養基進行無菌試驗，應無菌生長，還需靈敏度測試合格（已知試驗菌株）。

培養基的適用性檢查：

1、無菌性檢查。2、靈敏度檢查

無菌性檢查：每批培養基隨機取不少于5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無菌生長。

要點：空白培養，看是否長菌。

靈敏度檢查（簡要）：獲取特定菌種（如金葡、銅綠），制備菌液，使每ml含菌數小于100cfu。菌液在室溫應2小時內使用，在2-8度應24小時內使用。

?取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3天；

?取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養5天。逐日觀察結果。

?結果判定：空白對照管應無菌生長，加菌的培養基管均生長良好。

要點：接種試驗菌量小于100cfu，看是否生長，以觀察靈敏度。

方法的適用性檢查：

菌種與菌液制備同上。

薄膜過濾法：取每種培養基規定接種的供試品總量，按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨液體培養基至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。培養時間不得超過5天。

直接接種法：取硫乙醇酸鹽流體培養基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管。取胰酪大豆胨液體培養基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養基規定的供試品接種量，另1管作為對照，培養時間不得超過5天。

結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢査。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。

要點：用試驗菌測試，看供試品中是否有抑菌物質。如果有，則應使用中和劑或者增加沖洗量。

二、微生物限度檢查

1）微生物計數法

方法分為平皿法（傾注法、涂布法）、薄膜過濾法、MPN法(最可能數法)。

MPN法用于微生物計數時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。

培養基適用性試驗

制備試用菌液。設立陰性對照。

接種不大于100cfu的試驗菌液。每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在0.5?2范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致；被檢液體培養基管與對照培養基管比較，試驗菌應生長良好。

要點：使用“對照培養基”，被檢培養基與對照培養基培養結果應近似。同時，接種試驗菌液量不大于100CFU。

方法適用性試驗:

制備供試液。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法適用性試驗。

(1)試驗組 取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。

(2)供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

(3)菌液對照組 取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按試驗組操作加人試驗菌液并進行微生物回收試驗。

若有抗菌活性，則應增加稀釋液或培養基體積，或加入適宜的中和劑或滅活劑以去除或滅活。

平皿法：取供試液1ml（傾注法），置90mm的無菌平皿中，注入15?20ml溫度不超過45°C熔化的TSA或SDA培養基，混勻，凝固，倒置培養。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各試驗組的平均菌落數。若為涂布法，則供試液量不少于0.1ml。

薄膜過濾法：濾膜孔徑應不大于0.45μm，直徑一般為50mm。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取供試液適量（一般取相當于1g、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。濾膜菌面朝上培養基上培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。

MPN法：僅在供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法的情況下使用。該法不適用于霉菌計數。（略）

結果判斷

對于前兩法，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5?2范圍內；采用MPN法時，試驗組菌數應在菌液對照組菌數的95%置信限內。方法適用性確認時，若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

要點：存在三組即樣品+試驗菌液、樣品+稀釋液、稀釋液+試驗菌液。樣品中也含有菌。三組設定主要是為排除樣品對試驗菌液生長的影響，近似Spike試驗。“樣品+試驗菌液”減去“樣品+稀釋液”，應接近“稀釋液+試驗菌液”的情況，才算合格。

2）控制菌檢查法

如果供試品具有抗菌活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

培養基適用性檢查（使用對照培養基，還需制備試驗用的陽性菌株）。

菌種及菌液制備

設陰性對照，應無菌生長

培養基進行促生長能力、抑制能力及指示特性的檢査。如下表。

促生長能力和指示特性檢查：接種不大于100cfu的試驗菌

抑制能力檢查：接種不小于100cfu的試驗菌

控制菌檢查方法適用性試驗

供試液制備

試驗菌液制備

取規定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規定的培養基中；

采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后，注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中。依相應的控制菌檢查方法，在規定的溫度和最短時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。

結果判斷

上述試驗若檢出試驗菌，則合格；若未檢出試驗菌，則應消除供試品的抑菌活性，并重新試驗。如果經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。

要點：看試驗菌液能否檢出。在最后一次沖洗液中加入。能檢出即為合格。

三、培養基模擬灌裝試驗

此條依據食藥監局發布的《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》征求意見稿。

“確保滅菌后培養基的促生長能力，避免過度滅菌使培養基碳化造成其促生長性能的降低。為避免過度加熱可采用濕熱滅菌與除菌過濾聯合使用的方式，但均應進行促生長能力試驗。”

“6.3.5.1. 應在無菌工藝模擬試驗前及14天培養后按照現行中國藥典方法對培養基進行促生長能力試驗。

6.3.5.2. 促生長能力試驗使用的菌種包括：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、銅綠假單胞菌（CMCC10104）和生孢梭菌（CMCC64941）等。除標準菌株之外，還應考慮加入環境和無菌檢查中發現的典型微生物。促生長試驗接種量應不大于100CFU，按照中國藥典要求培養，以證明培養基能夠支持微生物的生長。”

“其它模擬介質的評價

  在使用模擬介質前應對其適用性進行確認，包括無菌試驗、抑菌試驗、溶解度試驗等。抑菌試驗通常使用枯草芽孢桿菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001）。除此之外，還應考慮加入環境和無菌檢查中發現的典型微生物。無菌模擬介質由無菌注射用水分散，然后加入到無菌培養基中，達到模擬工藝選用的濃度范圍。然后在每份培養基中接種10-100CFU。陽性對照接種到不含無菌模擬介質的試管中，在20-25℃培養7天所有試管應明顯渾濁。”