葉酸的檢測方法

近年來，葉酸對人類健康的影響越來越受重視，對葉酸檢測要求也就越來越高。由于各種樣品中成分復(fù)雜，葉酸的測定也比較復(fù)雜。葉酸含量的測定方法很多，例如：

1、高效液相色譜法( HPLC)

操作方法和所用藥品分析相似：稱取磨細(xì)的樣品置于離心管中，加入流動(dòng)相液體，超聲波提取15 min－30 min。取出后加入流動(dòng)相定容，搖勻后過濾，濾液用 HPLC 法分析。

高效液相色譜法的特點(diǎn)是測定結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便、省時(shí)省力、分析速度快、分離效果好，是近年來發(fā)展速度較快的測定葉酸的方法，分析操作方法和所用藥品分析相似，適合檢測純品，但分析成本高，液相色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴。

2、高效液相柱后衍生法

選用含 12%乙腈 +88% 0. 05 mmo l /L 磷酸二氫鉀溶液(pH =3.5)作為流動(dòng)相，流速 1 m l /m in， 經(jīng) ODS C - 18反相色譜柱分離, 柱溫設(shè)為 40℃，以0.5%過二硫酸鉀溶液為衍生劑，流速為0.3   mL /min， 反應(yīng)溫度為 60℃，使用熒光檢測器檢測定量，激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為 450 nm，外標(biāo)法測定葉酸含量。

本法利用葉酸經(jīng)氧化劑氧化后具有熒光特性，采用柱后衍生法熒光檢測器測定，大大提高了檢測葉酸的靈敏度(較紫外檢測提高了2個(gè)數(shù)量級)，避免了使用離子對試劑傷害柱子且能夠準(zhǔn)確定量，本方法簡單、快捷、靈敏，滿足日常分析要求。

3、同位素放射免疫法

同位素放射免疫法對多谷氨酸葉酸反應(yīng)的相對靈敏度有較大的差別，隨著葉酸濃度增加，反應(yīng)的相對靈敏度增加，但多谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線不可能與單谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線重合；另一方面，多谷氨酸葉酸與結(jié)合蛋白的親合性與單谷氨酸葉酸相比較高，不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應(yīng)靈敏度不同，放射免疫法也不適用于檢測單谷氨酸葉酸衍生混合物。

該方法具有快速、簡便的特點(diǎn)，同時(shí)由于葉酸放射免疫試劑盒的出現(xiàn)，很快得到普及，尤其廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。但放射免疫法可用于檢測和評價(jià)葉酸的營養(yǎng)狀況，從定量檢測的角度來講，難以得到準(zhǔn)確的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)值。

4、微生物測定法

此方法適用于食品中葉酸含量的測定，根據(jù)細(xì)菌對葉酸的營養(yǎng)需求，在一系列不含葉酸的培養(yǎng)基中從低到高添加已知含量的葉酸以及待測的食品樣品，在37°C培養(yǎng)18h。因?yàn)橛辛巳~酸，細(xì)菌能生長得很好，培養(yǎng)液發(fā)生渾濁。細(xì)菌越多，培養(yǎng)基就越渾濁，吸光度就越高。通過已知含量的葉酸樣品的吸光度，以及待測樣品的吸光度，就能確定待測樣品中的葉酸含量。

微生物測定法的特點(diǎn)是靈敏度高，樣品中被測物量含量極低時(shí)也能被測出。樣品處理簡單，不需要一系列的提純步驟，前處理操作步驟簡單。微生物法是目前應(yīng)用最為廣泛的，也是美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)的推薦方法，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于嬰幼兒食品和乳品中葉酸含量的測定，微生物法是**的測定方法。

國際上HiMedia公司生產(chǎn)的葉酸測定用培養(yǎng)基（貨號：M543），該培養(yǎng)基的特點(diǎn)是不含痕量葉酸，有效避免標(biāo)準(zhǔn)曲線偏移和本底過高，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，由國際認(rèn)證的GMP，CE和FDA，ISO9001，ISO13485等證書，成分符合《GB5009.211-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測定》。

5、離子捕獲法

該技術(shù)是目前葉酸檢測技術(shù)中較新的研究成果，即在實(shí)驗(yàn)中，樣品加入變性劑后葉酸與內(nèi)源性結(jié)合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結(jié)合，合成產(chǎn)物經(jīng)過離子捕獲池而與陽離子纖維結(jié)合，最后通過堿性磷酸酶與蝶酸（葉酸的類似物）結(jié)合物對葉酸結(jié)合蛋白上游離結(jié)合位點(diǎn)的探查，定量分析樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。當(dāng)離子捕獲法測定血清或紅細(xì)胞中的葉酸時(shí)，其結(jié)果與同位素放射免疫法的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

該方法主要用于臨床測定血清或紅細(xì)胞中的葉酸含量。

6、聚合酶鏈 － 限制性片段長度多態(tài)性測定法

聚合酶鏈－限制性片段長度多態(tài)性測定原理是擴(kuò)增產(chǎn)物用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 產(chǎn)物純化后酶切，經(jīng)3 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察帶型，根據(jù)帶型判讀基因型。通過基因型頻率計(jì)算等位基因頻率，以Hardy－Weinberg 平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性。

此方法檢測速度快，無離子輻射，操作簡單，可作為一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查和臨床應(yīng)用。

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