CCA顯色培養基在水的標準檢驗中的應用

國際知名微生物檢測產品生產商HiMedia Laborotaries公司生產的CCA顯色培養基（貨號：M1991I-500G，英文品名：HiCromeTM Chromogenic Coliform Agar）是一款值得注意的產品，因為它的成分和性能符合最新版的ISO9308-1標準（2014版），而該標準論述的正是有關大腸桿菌和大腸菌群計數的水質的標準檢驗。

ISO9308-1.2014采用的是濾膜法聯合CCA顯色培養基法，用于水中大腸桿菌和大腸菌群的計數。它出結果的時間更短，只有24小時（而2000年版ISO9308采用乳糖TTC瓊脂，需48小時），而且無須額外的培養基進行驗證試驗。

在CCA顯色培養基中，大腸菌群（不含大腸桿菌）表達β-D-半乳糖苷酶，分解顯色底物，從而為粉紅色菌落；大腸桿菌同時表達β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶，表現為藍紫色菌落；而其他非大腸菌群菌（如綠膿桿菌、沙門氏菌）為無色；糞腸球菌的生長則受到抑制。

圖. HiCromeTM CCA顯色培養基培養反應

為什么要同時檢測大腸菌群和大腸桿菌？對于人類來說，水被糞便污染一直是一個問題。大腸桿菌，其實是人腸道的正常菌群，它隨糞便被排出體外，因而被看作是水是否被糞便污染的指示菌。大腸菌群則較為復雜，因為有的大腸菌群生活在土壤和新鮮的地表水中，并不總是在人的腸道內。大腸菌群并不作為糞便污染的指征，但可以指示出水在凈化、儲存和運輸過程中存在的問題。

ISO9308-1.2014中的操作方法大致如下：先取水樣100ml（或其他體積），在5±3℃運輸和保存。應保證在取樣的24小時內檢測。再將水樣用濾膜過濾。過濾膜應47mm或50mm直徑，0.45μm孔徑，**有網格線，并且需保證無菌。過濾后細菌就被截留在濾膜上，然后將濾膜貼到CCA顯色培養基上。放置時應保證下面沒有氣泡。然后倒轉平板，孵育21±3小時，36±2℃。之后就可檢查過濾膜上的菌落并計數。

ISO9308-1.2014指出，顯色后，大腸菌群（粉紅色菌落）應再用氧化酶試紙條進行驗證試驗（大腸菌群為氧化酶陰性），因為一些氧化酶陽性菌(如氣單胞菌屬)可能帶來假陽性。具體是應至少選擇10個粉紅菌落，進行氧化酶試驗，或向平皿中的濾膜滴加氧化酶試劑2-3滴，陽性反應為深藍色（30秒內）。大腸桿菌無須驗證。如需驗證時，可進行吲哚試驗。大腸桿菌為吲哚試驗陽性，而其他大腸菌群為陰性。

值得指出的是，該標準方法選擇性不強，它適合低菌群背景的樣本，因為背景生長可能干擾計數。ISO指出，它最適合菌落數小于100的水樣，例如：飲用水、自來水、消毒的池水，而對于地表水和井水，該方法并不適合。

注意：對于大腸桿菌O157，CCA培養基不會將其識別為大腸桿菌。大腸桿菌O157將被識別為大腸菌群。對于總大腸菌群計數，它應等于氧化酶陰性的粉紅色菌落數+藍紫色菌落數。

據ISO資料顯示：CCA培養基的靈敏度為94%（大腸桿菌）和91%（大腸菌群），特異性為97%（大腸桿菌）和94%（大腸菌群），可見性能還是相當不錯的。而HiMedia公司更提供有化學限定的CCA顯色培養基，這保證培養基的批間差異極小，批次結果穩定，重復性和準確度進一步提升。

我國《GB8538—2016食品安全國家標準·飲用天然礦泉水檢驗方法》提到濾膜法計數大腸菌群。具體是將過濾水樣的濾膜貼在選擇性鑒別培養基上，經 37℃ 培養24h后，大腸菌群細菌在濾膜上長出具有特征性的菌落，直接計數典型菌落數，計算出每 100mL 水樣中所含的大腸菌群數。所用培養基為遠藤瓊脂(品紅亞硫酸鈉)培養基。長出的菌落還需進行革蘭氏染色鏡檢觀察。如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養液，經36℃±1℃培養 24h±2h 后，如產酸產氣則判定為大腸菌群陽性。整體耗時較長，步驟較多。

《GBT5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法——微生物指標》檢測指標包括總大腸菌群和大腸埃希氏菌，都提到酶底物法。總大腸菌群也是根據用選擇性培養基上篩查β-半乳糖苷酶陽性菌，并提到“可選用市售商品化制品，以此計數來檢測水中總大腸菌群”。大腸埃希氏菌是根據β-葡萄糖醛酸酶。檢測方法是兩類菌分開論述的。而CCA顯色培養基可同時計數并鑒別這兩類菌，不可不謂具有更高的效率。

據悉，上海市質量技術監督局已通知，將要更新發布《DB31/T 1091-2018 生活飲用水水質標準》，2018年10月1日開始實施。這雖然是地方性的條例，但畢竟對2006年的國標進行了一些改進，估計可能會采納ISO9308-1.2014的方法。