微生物法測定維生素B12的方法學評估

微生物法測定維生素B12的方法學評估

在我國，微生物法測定食品中的維生素B12、葉酸、泛酸、煙酸、生物素是首選方法，因此在國民生計中起到重要作用。本文擬以維生素B12為例，從方法學的角度就微生物法的特點，作一文獻上的綜述。

1954年，微生物法測定乳品中的維生素B12**出現，是由英國國立奶業研究所、維生素B12的研究專家Margaret E. Gregory首先建立，她用該法測定來自不同動物種屬的奶中的維生素B12的含量（1）。

微生物法測定乳品和食品中的維生素B12，在上世紀90年代引入我國。關于這一方法，已有多篇報道進行了方法學上的探討?，F總結如下：

（一）對微生物法的評估

上海市食品藥品檢驗所蔣孟虹等人用微生物法測定了腸內營養粉劑中的維生素B12 含量。她們認為，高效液相色譜法僅適用于常量分析,維生素B12對色譜前處理要求高, 因此色譜很難滿足痕量測定的要求。但微生物法操作步驟較多, 一些因素可能影響測定結果的準確性。因此，她們對影響因素進行了研究，結果發現：

?測試菌液的透光率在60%～80%之間時, 標準曲線的線性擬合較好，過高過低均導致線性擬合差。

?當測試菌液的加入量為50μL時, 標準曲線線性擬合良好。過多易導致濁度過高而不成梯度。

?標準曲線最高濃度點的透光率在30%左右為**測定時間, 此時各濃度點的透光率差別較大, 可拉開梯度。

?維生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 濃度范圍內線性關系良好。

她們認為，微生物法檢出限低、靈敏度高,測定結果準確可靠, 適用于微量維生素B12的含量測定, 值得經常進行維生素檢測的實驗室應用推廣（2）。

國家乳制品質量監督檢驗中心的張玉杰等人提出：微生物法的好處是，測定的是維生素的生物活性含量，更具生物學意義。同時，微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使得測定結果更為準確。微生物分析法測定VB12在國際上已有幾十年的歷史，只是在我國報導還不是很多。

他們采用微生物法對12個奶基嬰幼兒食品的VB12含量進行了多次重復測定，發現相對誤差均在10%以內，50%的樣品測定的誤差小于5%，回收率多在90-110%之間。因而該方法是可行的，結果也是準確可靠的（3）。

廣東產品質量監督檢驗研究院林耀文等人發現，微生物法測定含乳飲料中的維生素B12，重復性良好，線性相關系數大于0.99，平均回收率為91.20%～102.2%，檢出限為0.04ng/ml，具有簡便、快速、靈敏度高、檢出限低等優點。（5）

（二）微生物法的干擾因素和注意事項

國家乳制品質量監督檢驗中心的張玉杰等人提出了幾點注意事項：

**，有些細菌可以產生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要嚴格清洗，嚴格滅菌。清洗后**放入250℃烘箱，加熱1-2小時。整個分析過程都要注意防止溶液過多地暴露于光線中。

第二，建議每個梯度標準溶液設三個平行檢驗管，減少誤差。所有檢驗管滅菌后要迅速水冷卻，盡量避免顏色形成。冷卻速度要一樣。

第三，測定菌體濃度時，要等檢驗管內發育和繁殖過程完全停止后再進行。（3）

湖北省宜昌市產品質量監督檢驗所陳緒華等人觀察了測定培養基的不同品牌對維生素B12線性的影響。發現青島海博和北京陸橋的維生素B12測定培養基作出的線性結果不理想，主要是培養基所含的本底較高。而更換為BD的測定培養基后，所得的線性結果較理想。本底存在，會導致目標物質的促生長作用減弱（即吸光度沒有等量增加）。當測定培養基中不含本底時，菌懸液以及培養時間的微弱變化只影響標準曲線的生長量，不影響曲線的線性。（4）

據我們了解，目前BD的維生素B12測定培養基已停產，因此可選用國際知名的微生物生產商HiMedia的產品。

上海市質量監督檢驗技術研究院王志偉等人強調，菌種的活力和純度對實驗結果有非常大的影響，應嚴格按照要求進行菌種純化（7）。

（三）對標準微生物法的改進

廣州市質量監督檢測研究院吳環等人提出了幾個更簡便的操作技巧用于維生素B12的測定：一是試驗體系的體積縮小。用1.2ｍlPP小管替代了傳統的試管進行標準曲線溶液及樣品溶液的培養和測定；標準曲線溶液和樣品溶液的制備也在1.2mlPP小管中進行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同時顯著降低了外部干擾；二是將試驗菌株預先固定在96排管，利用甘油保護冷凍的菌種。具體操作為：將萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株活化后，接種到乳酸桿菌肉湯培養基，（36.0±1.0）℃培養18～24h，將增菌肉湯培養物3000r/min離心數次，棄去上清液，使用含有甘油的維生素B12測定培養基進行適宜的稀釋后，將菌懸液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃凍存備用。該方法極大地縮短了試驗周期，而且菌株活力穩定，保證了試驗的有效性。（6）

吳環等人進一步將該方法推廣到嬰幼兒配方乳粉中的其他3種水溶性維生素（葉酸、生物素、肌醇）的測定，結果同樣有效。（8）

上海市質量監督檢驗技術研究院王志偉等人對于天然燕麥的維生素B12的測定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，發現酶解溶液有助于提取維生素B12，降低樣品粘度，更方便測量，因此優于現有的標準方法。

以上探討雖然大部分是針對維生素B12,但對于采用微生物法測定的其他水溶性維生素如葉酸等也同樣有效，可以借鑒。

參考文獻：

1) Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340

2）蔣孟虹、許蘋等. 微生物法測定腸內營養粉劑中微量維生素B12 的含量.食品安全質量檢測學報. 2016,7(3):893-897

3）張玉杰、呂為群.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定微生物分析法.生物技術,1993(6):39-43

4）陳緒華、劉健、江一飛. 不同測定培養基對維生素B12線性的影響. 生物技術世界. 2013(4):47

5）林耀文、佘之蘊，李姣等.微生物法測定含乳飲料中維生素B12含量. 飲料工業.2013,16(4):39-42

6）吳環、劉冬虹、張慧、聶炎炎、黃宇峰.微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應用研究.中國乳業.2014,(4):42-44

7)王志偉、徐瓊、陳欣欽、曲勤鳳. 天然燕麥中維生素B12的測定中2種微生物法前處理方式的比較.食品安全質量檢測學報, 2017,8(1):275-279

8）劉冬虹，吳環，聶炎炎，黃宇鋒. 優化微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中4種水溶性維生素.華南預防醫學,2014(6):594-597