利用CRISPRCas9誘導的DNA瘢痕序列追蹤細胞譜系

如今，諸如RNA測序之類的技術正在揭示出哪些基因在每個細胞中表達。隨后，科學家們就能夠利用類似的表達譜對所有的細胞進行系統性地分類。德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心數量發育生物學研究小組負責人Jan Philipp Junker博士說，“當我們使用這種技術研究器官或有機體時，我們不僅發現熟悉的細胞類型，我們也會發現未知的和罕見的細胞類型。下一個問題很明顯---這些不同的細胞類型來自于何處？”針對于這一點，在一項新的研究中，Junker團隊開發出一種被稱作LINNAEUS（lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitous sequence, 通過對普遍存在的序列進行核酸酶激活的編輯來開展譜系追蹤）的技術，它能夠讓人們確定細胞類型和每個細胞的譜系。相關研究結果于2018年4月9日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為“Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars”。

Junker說，“我們想要理解有機體發育的靈活性。”如果在胚胎發育期間發生損傷（比如，由突變或環境影響導致的損傷），那么修復機制就應確保動物在以后看起來顯得健康。僅每個細胞的譜系才能夠揭示損傷程度和修復機制的真實情形。即便是成年斑馬魚的心臟在遭受損傷后也能夠再生。Junker說，“這是生物學發育過程在自我重復，還是有新的事物出現？細胞是否會發生改變并承擔其他任務？”在某些情況下，一種細胞類型的缺失可導致特定疾病。在未來，科學家們將能夠使用LINNAEUS可追蹤的所有細胞譜系樹，并針對這些問題提出新的假說。

快速修復會導致瘢痕序列產生

這種技術基于DNA中的瘢痕序列（scar sequence），這些瘢痕序列當匯總在一起時就像條形碼一樣發揮作用，能夠確定每個細胞的譜系。雖然斑馬魚胚胎仍處于單細胞階段，但是Junker團隊給這些胚胎注入CRISPR-Cas9系統。在接下來的8個小時內，Cas9重復性地切割斑馬魚從不需要的基因序列：編碼紅色熒光蛋白（RFP）的基因。這些斑馬魚胚胎產生的紅色熒光逐漸消失，而且數千個瘢痕序列在DNA損傷區域中形成。Junker說，“CRISPR總是在確切的位點上進行切割。但是，在下一次細胞分裂發生之前，這些細胞的修復時間不超過15分鐘。這種修復工作必須快速完成，這樣染色體片段就會連接在一起。這也是錯誤發生的地方。DNA中的瘢痕序列具有隨機的長度，而且它們的確切位置也會發生變化。”子細胞在細胞分裂過程中遺傳這些瘢痕序列。因此，源自相同祖先的細胞能夠通過它們的遺傳性瘢痕序列來加以鑒定。

盡管單細胞RNA測序可依據細胞類型繪制數千個細胞的圖譜，但是這些瘢痕序列表明這些細胞之間存在著數百萬個連接。利用這些數據重建細胞譜系樹面臨著各種各樣的挑戰。有些瘢痕序列是特別可能會發生的。Junker說，“這是危險的，這是因為如果相同的瘢痕序列都在心臟細胞和腦細胞中產生，那么人們就可能會錯誤地認為它們具有相同的祖先。因此我們必須知道哪些瘢痕序列是不值得我們信任的，并將它們濾除掉。”此外，論文共同**作者、馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心生物信息學家Bastiaan Spanjaard說，并非細胞中的所有瘢痕序列都是能夠找到的。“因此，我們開發出一種方法來彌合能夠讓我們構建出細胞譜系樹所需的數據上的差距。”

聚焦數據集

最終的結果是構建出具有彩色餅圖的細胞譜系樹，并在餅圖上進行分支劃分。每個劃分都是依據瘢痕序列，餅圖上的每種顏色指出這個劃分是在哪個細胞類型中發生的。研究人員能夠根據他們想要的細節聚焦這個非常大型數據集的緊湊表示。

Junker說，“比如，在心臟中，有兩種細胞類型是幾乎沒有區別的。但是這些細胞譜系樹表明它們的發育很早就在不同的方向上發生分叉。我們接下來想要觀察這些細胞類型存在于斑馬魚心臟中的何處。這通常為它們發揮何種功能提供首個指示。”他的實驗室正在繼續使用斑馬魚作為模式生物開展研究，但是Junker也認為將該技術應用于人體類器官中具有巨大的潛力。這最終能夠幫助人們理解患者中的哪些突變會導致細胞譜系樹遭受**性損傷。