開發出冰凍組織高通量單細胞核測序方法，繪制人腦第二代單細胞圖譜

　　大腦是人體中最為復雜的器官，盡管它有著巨大作用，但是人們對其功能仍了解甚微。據估計，人類大腦擁有約 1000 億個神經元分布于不同腦區，形成極度復雜的神經網絡。另外腦內還有數目比神經元更多的膠質細胞。傳統的細胞分類方法只能根據少數已知細胞的分子標記進行分類，對每一類大腦細胞的認識也非常有限。

　　隨著分子技術的發展，基于不同類型細胞的基因表達模式差異，科學家通常利用單細胞 RNA 測序，對細胞類型進行鑒定，確定神經元的亞型，進而為構建完整大腦細胞圖譜奠定基礎。今年 10 月 16 日，“人類細胞圖譜計劃”(the Human Cell Atlas) 首批擬資助的 38 個項目正式公布。這一大型國際合作項目致力于建立一個健康人體所包含的所有細胞的參考圖譜，并以此加深對疾病診斷、監測、治療的了解 。

　　但目前，構建完整的大腦細胞圖譜仍受到多種條件的限制。首先，科學家仍需要一種高通量且無偏差的單細胞檢測方法，而不受樣本新鮮程度和活細胞分離的限制。此外，盡管轉錄組表達譜可以發現不同細胞類型在復雜組織中的功能差異，但仍需更多維度的人腦單細胞檢測技術，以揭示不同人腦細胞中更全面的基因表達和調控信息。

　　加州大學圣地亞哥分校張鹍教授團隊 2016 年在 Science 上發表了**個成年人腦單細胞神經元表達譜。近日，該團隊在 Nature Biotechnology 上發表了一個基于全新單細胞核測序方法的成年人腦第二代單細胞圖譜，再次引爆了單細胞研究的熱點。

　　首先，研究團隊將視線聚焦于腦組織提取的神經元和膠質細胞單細胞核，克服了樣本的限制，使該方法可以應用于新鮮或凍存的腦組織，實現了凍存組織的大規模單細胞檢測，且不受組織細胞解離的影響。另外，這項研究的一個創新之處在于結合了兩種新一代高通量單細胞技術：基于微流體的單核測序(snDrop-seq)和單細胞轉座體超敏性位點測序(scTHS-seq)的方法，不僅能利用轉錄組學分析鑒定不同功能的細胞類型，還能通過表觀遺傳特征更好地描述這些表達譜是如何調節或維持的，從而提供一個更全面的單細胞圖譜。

　　該研究中，基于微流體的單核測序技術(snDrop-seq)，不僅可以對成千上萬個單細胞同時進行轉錄組分析，從多方面對細胞類型和細胞狀態進行分類，還可用于評估新鮮和凍存人體組織中的特異性表達譜，有助于研究組織的功能異質性。值得一提的是，該技術還攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起 RNA 過度降解的難題。

　　為同時研究表觀遺傳特征，該團隊開發了 scTHS-seq 技術。scTHS-seq 擁有具有體外轉錄擴增的線性優勢和改造后的超級突變 Tn5 轉座酶，比 ATAC-seq 靈敏度更高，還提高了對被認為高度細胞特異性的遠端增強子 (distal enhancers) 的覆蓋率。

　　研究團隊聯合應用以上兩種互補的方法最終建立了這種可并行檢測細胞核轉錄本和表觀遺傳特征的高通量測序平臺，為綜合分析凍存人體組織樣本中基因表達和調節提供了途徑。研究人員用此方法檢測了超過 60,000 個來自成人大腦皮層和小腦的單細胞，發現了 35 種不同的神經元和神經膠質細胞亞型。值得一提的是，去年 Science 發表的**代圖譜因為技術限制忽略了各種類型的神經膠質細胞。現在，這些膠質細胞在新一代圖譜里得到了完整的描述。

　　此外，他們還將常見的人腦遺傳疾病相關的遺傳位點定位到特定的細胞類型，揭示了大腦中哪些細胞類型更易受腦部疾病遺傳因子的影響。例如，他們發現神經膠質細胞的兩種亞型小膠質細胞和少突膠質細胞分別是阿爾茨海默病遺傳因子的**和第二突破口。

　　張鹍教授表示，關于腦部疾病的發病根源有多種理論，我們的發現有助于確定大腦中哪種類型的細胞最容易受到遺傳風險因子的攻擊。我們的最終目標是繪制一個完整的人腦細胞圖譜。目前，研究小組正計劃進一步擴大研究范圍來繪制大腦其他區域的細胞圖譜。

　　隨著前不久前“人類細胞圖譜”計劃的開展，單細胞測序的研究熱情必然持續高漲。這種方法無疑為研究人類大腦的復雜機理、構建完整大腦細胞圖譜提供了基礎。我們可以相信，未來這種綜合的多組學方法必將在復雜器官和組織的單細胞研究中發揮愈發強大的作用。